Diplômée du Conservatoire d’art dramatique de Québec en 1984, Guylaine Tremblay passe les cinq années suivantes à jouer sur toutes les scènes de la Ville de Québec dans plus de quarante productions théâtrales.
En 1991, elle décide de poursuivre sa carrière à Montréal où elle commence sa collaboration auprès du Théâtre Expérimental de Robert Gravel, en plus de joindre les rend de la LNI. On peut découvrir son talent exceptionnel dans une foule de projets théâtraux, plus divers les uns que les autres : Lion dans les rues, Durocher le Milliardaire, Matroni et moi, Albertine en 5 temps, C’était avant la guerre à l’Anse-à-Gilles, 24 Poses, Les voisins, Là, Ça se joue à deux, Belles-Sœurs, Encore une fois si vous permettez, Enfant insignifiant, Les étés souterrains (premier solo au théâtre qui a été également diffusé en direct à Télé-Québec) et tout récemment dans le spectacle J’sais pas comment, J’sais pas pourquoi où elle se raconte à travers les chansons d’Yvon Deschamps.
À la télévision en 1993, elle incarne le rôle de Caro dans La Petite Vie qui la fera connaître du grand public. Par la suite les rôles se succèdent : Quatre et demi, Histoires de filles, Emma, Annie et ses hommes, Les rescapés, En tout cas, Unité 9, Anna et Arnaud sans oublier sa participation depuis 2019 au Bye-Bye de fin d’année diffusée à la télévision nationale.
Au cinéma, on a pu la voir dans Matroni et moi, Mariage, Trois temps après la mort d’Anna, 20h17 rue Darling, Le vrai du faux, 23 Décembre et dans Contre tout espérance. Ce dernier rôle a valu à Mme Tremblay, en 2008 le prix Jutra de la meilleure actrice.
Son talent diversifié l’a amenée à être animatrice du magazine Banc public pour lequel elle recevra le prix de la meilleure animation en 2019 et professeure d’interprétation à Star académie en 2022.
Depuis plusieurs années, les interprétations de Guylaine Tremblay sont reconnues et récompensées par de nombreux prix venant du milieu artistique (8 Gémeaux) et du public (23 Artis). En 2022, elle reçoit la médaille de l’ordre du Canada soulignant sa prolifique carrière artistique et son implication social auprès de sa communauté. Le 21 juin 2023, elle est récipiendaire de l'Ordre nationale du Québec à titre de chevalière pour son activité exemplaire comme artiste.
